肥料中糞大腸菌群的測(cè)定

         1　范圍
    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了肥料中糞大腸菌群的測(cè)定方法。

         2　定義
    糞大腸菌群  fecal coliforms系指一群在隔水式恒溫培養(yǎng)箱44.5℃±0.5℃條件能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。糞大腸菌群數(shù)為每克（毫升）肥料樣品中糞大腸菌群的MAX可能數(shù)（MPN）。

         3　設(shè)備和材料
    •　高壓蒸汽滅菌器。
    •　顯微鏡。
    •　恒溫水浴或隔水式培養(yǎng)箱。
    •　恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床。
    •　鼓風(fēng)干燥箱。
    •　天平。
    •　酸度計(jì)或精密pH 試紙。
    •　接種環(huán)。
    •　試管（15mm×150mm）。
    •　小套管（杜蘭管）。
    •　移液管。
    •　三角瓶。
    •　培養(yǎng)皿。
    •　載玻片。
    •　玻璃珠。
    •　酒精燈。
    •　試管架。

         4　培養(yǎng)基和試劑
         4.1　培養(yǎng)基：遵照附錄A的規(guī)定。
         4.2　革蘭氏染色液：遵照附錄B的規(guī)定。

         5　檢驗(yàn)步驟
         5.1　樣品稀釋
    在無(wú)菌操作下稱取樣品10.0g或吸取樣品10mL，加入到帶玻璃珠的90 mL無(wú)菌水中，置于搖床上200 r/min充分振蕩30min，即成10-1稀釋液。
    用無(wú)菌移液管吸取5.0 mL上述稀釋液加入到45 mL無(wú)菌水中，混勻成10-2稀釋液。這樣依次稀釋，分別得到10-3，10-4等濃度稀釋液（每個(gè)稀釋度須更換無(wú)菌移液管）。

         5.2　乳糖發(fā)酵試驗(yàn)
    選取三個(gè)連續(xù)適宜稀釋液，分別吸取不同稀釋液1.0mL加入到乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，每一稀釋度接種3支發(fā)酵管，置44.5℃±0.5℃恒溫水浴或隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h±2h。如果所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，則為糞大腸菌群陰性；如果有產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸的發(fā)酵管，則按5.3進(jìn)行。

         5.3　分離培養(yǎng)
從產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸的發(fā)酵管中分別挑取發(fā)酵液在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上劃線，置36℃±1℃條件下培養(yǎng)18h～24h。

         5.4　證實(shí)試驗(yàn)
         從5.3分離平板上挑取可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色。染色反應(yīng)陽(yáng)性者為糞大腸菌群陰性；如果為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌則挑取同樣菌落接種在乳糖發(fā)酵管中，置44.5℃±0.5℃條件下培養(yǎng)24h ±2h。觀察產(chǎn)氣情況，不產(chǎn)氣為糞大腸菌群陰性；產(chǎn)氣為糞大腸菌群陽(yáng)性。

         5.5　結(jié)果
         證實(shí)實(shí)驗(yàn)為糞大腸菌群陽(yáng)性的，根據(jù)糞大腸菌群陽(yáng)性發(fā)酵管數(shù)，查MPN檢索表，得出每克（毫升）肥料樣品中的糞大腸菌群數(shù)。